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021-50276769哈嘍，上期小編帶領大家簡單了解了下高效液相色譜和超高效液相色譜的差異，相信大家通過小編的介紹對兩者有了比較具體的了解。那么隨著小粒徑色譜柱的發(fā)展，越來越多的業(yè)內(nèi)人士期望使用亞2μm粒徑色譜柱的超高效液相色譜來拓寬選擇性、提高工作效率、降低耗能、減少污染。
今天小編就帶領大家看下如何將HPLC方法轉(zhuǎn)換為UHPLC方法。
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保證轉(zhuǎn)換成功的前提
● 相同的選擇性：選擇相同品牌，相同鍵合工藝制成的填料僅僅是粒徑不一致。
● 相同或者更大的柱長粒徑比：這是保證具有相當或者更高的理論塔板數(shù)。
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方法如何轉(zhuǎn)換
● 針對兩者差異進行轉(zhuǎn)換研究：色譜柱填料粒徑不同，系統(tǒng)體積不同，儀器輸送流動相系統(tǒng)內(nèi)徑不同，影響流速，進樣量，梯度洗脫程序。
● 需要調(diào)整參數(shù)：流速，進樣量，梯度洗脫程序。
1. 流速與柱半徑的平方成正比
例如：
HPLC柱：4.6*150mm，5μm 流速：1.5mL/min
UHPLC柱：2.1*100mm，1.8μm流速則為：
2. 樣品濃度不改變，進樣體積與柱體積成正比
例如：
HPLC柱：4.6*150mm，5μm 進樣體積：20μL
UHPLC柱：2.1*100mm，進樣體積則為：
3. 梯度洗脫程序的轉(zhuǎn)換
等度方法只需要調(diào)整流速和進樣量，如果是梯度洗脫則需調(diào)整梯度洗脫程序。調(diào)整的依據(jù)，需計算在幾何縮放的流速下輸送相同倍數(shù)柱體積溶劑到目標柱需要的時間。
同時，由于不同儀器之間系統(tǒng)體積存在差異，也需要在轉(zhuǎn)換時加以考慮。梯度程序轉(zhuǎn)換的計算過程這里不做詳細描述。通常色譜儀器均配備轉(zhuǎn)換軟件，輸入原始洗脫程序，軟件可自動計算并轉(zhuǎn)換為目標儀器的洗脫，然后根據(jù)色譜峰分離情況進行人工微調(diào)。
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方法參數(shù)的優(yōu)化
1. 改善分離度：調(diào)整梯度洗脫程序，增加長度是便捷可行的措施；
2. 如果破壞試驗檢測的雜質(zhì)情況不一致，轉(zhuǎn)換后的雜質(zhì)多且物料平衡優(yōu)于前者，兩者測定結(jié)果沒有明顯區(qū)別，轉(zhuǎn)換成功；
3. 如果結(jié)果明顯不一致，或涉及不合格情況，應匯報相關負責人，是否需要對原方法進行再評估或放棄方法轉(zhuǎn)換。
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什么時候為轉(zhuǎn)換失敗
1. 原則：系統(tǒng)適用性實驗不符合要求；
2. 分離度調(diào)整后達不到要求；
3. 破壞性實驗檢測出來物料平衡明顯不如HPLC法，方法優(yōu)化后不能解決；
4. 檢測結(jié)果與HPLC不一致，甚至出現(xiàn)不合格，那需要對原方法進行評估或者放棄方法轉(zhuǎn)換。
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UHPLC轉(zhuǎn)換方法需要驗證的項目
1. 原則：系統(tǒng)適用性實驗符合要求；
2. 峰純度達到要求；
3. 分離度達到要求；
4. 靈敏度達到要求；
5. 沒有系統(tǒng)適用性要求的項目進行樣品2-3種條件的破壞性實驗，雜質(zhì)分離和物料平衡均要相當。
在日常工作中，當HPLC方法成功轉(zhuǎn)換為UHPLC方法后，不僅僅拓寬選擇性和提高工作效率，還降低耗能以及減少了污染。
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